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在当代生物医学盘考限度，生物发光成像技巧凭借其非侵入性、无需外加光源以及高聪惠度的独有上风，照旧成为盘考生物体内多样生理和病理经过的挫折器具。非常是跟着1月22日一项盘考效力（An improved pathway for autonomous bioluminescence imaging in eukaryotes）在Nat Methods（IF 48）杂志上的发表，科学家们通过对霓虹灯菌(Neonothopanus nambi)中的生物发光阶梯进行改造，成效杀青了在植物、真菌和哺乳动物宿主中自主发光亮度的权贵进步，这一建设无疑为生物发光成像技巧的进一步发展和等闲应用提供了强有劲的支抓。

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当然界的生物发光表象一直是科学家们盘考的热点话题。霓虹灯菌的发现为在非自觉光的真核生物中引入自主发光的可能性提供了新的想路。关系词，将这一表象应用于异源宿主时，由于原生真菌酶的性能遏抑，其发光亮度时常难以得志实验要求，这成为推行其应用的一大羁系。

在这项盘登第，科学家们成效优化了真核生物中的自主生物发光阶梯，权贵提高了在植物、真菌和哺乳动物宿主中的生物发光亮度。通过对Neonothopanus nambi真菌中的生物发光阶梯组分进行定向进化和改造，盘考团队成立出了两种优化的生物发光阶梯版块：FBP2和FBP3，它们在多种宿主中杀青了比原始阶梯（FBP1）跳动一个到两个数目级的发光亮度。

盘登第波及对两个关节酶nnLuz（荧光素酶）和nnH3H（hispidin-3-羟化酶）的改造。对nnLuz的定向进化产生了含有三个氨基酸替换（T99P, T192S和A199P）的nnLuz_v3变体，这些替换加多了其在细菌和哺乳动物细胞中的自若性和亮度。进一步的立时突变产生了nnLuz_v4，它包含了寥落的四个氨基酸替换（I3S, N4T, F11L和I63T），在酵母中流清楚改善的热自若性和催化活性。

nnH3H的定向进化详情了五个增强亮度的氨基酸替换（D37E, V181I, A183P, S323M和M385K）。通过组合这些突变，得到了进一步增强亮度的nnH3H_v2。

此外，盘考还发现，来自Mycena citricolor的hispidin合成酶mcitHispS在多种异源宿主中的证明优于nnHispS，尤其是在植物中。通过将改造后的酶组合在沿路，酿成了FBP2（包含nnHispS, nnH3H_v2, nnLuz_v4, nnCPH和NpgA）和FBP3（包含mcitHispS, nnH3H_v2, nnLuz_v4, nnCPH和NpgA）两种优化阶梯。

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在实验中，FBP2和FBP3在植物、酵母和哺乳动物细胞培养系统中证明出了彰着的亮度上风。非常是在植物中，FBP2和FBP3不仅提高了发光亮度，何况在六个代表四个双子叶植物科的物种中杀青了自若的转基因抒发，这些物种包括格局植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）和香烟（Nicotiana benthamiana），以及快速助长的树种加拿大杨（Populus canadensis）、不雅赏植物矮牵牛（Petunia hybrida）和菊花（Chrysanthemum morifolium）。

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盘考收尾标明，FBP2和FBP3具有在植物中杀青视频速度生物发光成像的后劲，即使在幽微的外部光照条款下也能使用糟践级相机可靠地监测植物的生物发光。最亮堂的组织——矮牵牛的花蕾甚而不错使用当代智高东说念主机相机进行记载。

转基因植株自若抒发生物发光阶梯不同版块的发光性：3周龄尼古丁树叶的平均亮度（Credit: Nat Methods）

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Methods速览

定向进化与共鸣突变分析：对N. nambi的荧光素酶nnLuz和hispidin-3-羟化酶nnH3H进行定向进化和共鸣突变分析，通过筛选赢得具有增强自若性和亮度的nnLuz_v3和nnLuz_v4变体，以及提高亮度的nnH3H_v2变体。

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基因抒发与瞬时转染：将改造后的生物发光基因构建到抒发载体中，并通过瞬时转染的形势将其引入植物（如香烟Nicotiana benthamiana和拟南芥Arabidopsis thaliana）、酵母（如Pichia pastoris）和哺乳动物细胞（如东说念主类HEK293细胞）中，以评估改造阶梯的生物发光性能。

酶活性与热自若性测试：在细菌、酵母和哺乳动物细胞中测试改造酶的活性和热自若性，通过添加底物并使用荧光计或相机捕捉发光信号，从而评估酶的性能。

2023年5月13日，在清华大学建校112周年深圳庆祝大会的现场，清华大学校歌的悠扬旋律，鼓舞并震撼着在场每一位清华师生、校友的心灵。

农杆菌介导的植物动荡：期骗农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的震上路手，将改造的生物发光基因自若整合到植物基因组中，创建概况自若发光的转基因植物系。

发光成像与数据分析：使用IVIS Spectrum CT等成像系统或平日数码相机，在无外部光源的条款下拿获植物、细胞或酵母的自主生物发光图像。通过图像科罚软件对拿获的图像进行分析，定量评估发光信号的强度和隔离。

这一编削性盘考效力的杀青，极地面拓宽了生物发光成像技巧在植物学、神经科学、发育生物学等多个学科限度的应用鸿沟，同期也为今后的盘考提供了新的主义。其齐全基因编码的特质，使实验操作变得愈加便捷，大大裁汰了盘考老本，提高了实验效力。改日，跟着对该技巧的进一步优化和改进，预期将在更等闲的生物体系中杀青更高效、更自若的自主发光，为生物医学盘考乃至临床会诊提供愈加庞杂的技巧撑抓。

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参考文件

https://www.nature.com/articles/s41592-023-02152-y

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